免疫組化流程
??
免疫組化可以：（1）惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；（2）確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位,；（3）對(duì)某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型,；（4）發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定,，包括手術(shù)范圍的確定,。
即用型(Envision)快速酶免疫組化二步法
實(shí)驗(yàn)方法原理 根據(jù)聚合酶技術(shù)把辣根過氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚酶上形成多聚物分子,其與待檢的抗原特異性的結(jié)合后，加入底物顯色,。
實(shí)驗(yàn)材料 石蠟切
試劑,、試劑盒 PBS檸檬酸鹽緩沖液蒸餾水增強(qiáng)劑酶標(biāo)抗鼠 兔聚合物蘇木素酒精二甲苯樹膠鹽酸二氨基聯(lián)苯胺
儀器、耗材 烘箱微波盒塑料切片架顯微鏡膠頭滴管
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時(shí),，脫蠟至水,，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。
二,、取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液,，加入微波盒中，微波加熱至沸騰,，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上,，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘,，取出微波盒流水自然泠卻,，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次,，之后用PBS沖洗2×3’,。（注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的，視具體情況而定）
三,、每張切片加1滴3%H2O2,，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,。PBS沖洗3×3’,。
四、除去PBS液,，每張切片加1滴相應(yīng)的第一抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)）,，室溫下孵育2小時(shí)。
五,、PBS沖洗3×5’,。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑,，室溫下孵育20分鐘,。PBS沖洗3×3’。
六,、除去PBS液,，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘,。PBS沖洗3×5’,。
七、除去PBS液,，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液（二氨基聯(lián)苯胺）,，顯微鏡下觀察5分鐘。
八,、蘇木素復(fù)染,，0.1%HCl分化,，自來水沖洗，藍(lán)化,，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥,，二甲苯透明，中性樹膠封固,，晾干后觀察,。
其他
一、特點(diǎn)
1. 在切片加上一抗后,，第二抗體標(biāo)記多聚螯合物酶（HRP）的復(fù)合物與一抗結(jié)合,，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信號(hào)有顯著的放大,，其敏感性較SABC,、SP法高。
2. 由于多聚物在體內(nèi)不存在,，又不使用生物素,，從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色，背景比SABC,、SP法清晰,。
3. 辣根過氧化物酶與二抗結(jié)合在多聚物上，替代傳統(tǒng)方法的 二抗,、三抗,，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，且試劑孵育時(shí)間短,，只需15分鐘,，使得免疫組化方法更簡單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間比SABC,、SP法大為縮短,。
鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)SP法
實(shí)驗(yàn)方法原理
SP（streptavidin-perosidase）法，即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法,。SP法是最常使用的方法,。
試劑、試劑盒 二甲苯酒精PBS雙氧水枸櫞酸緩沖液羊血清工作液辣根過氧化物酶鏈霉素卵白素蘇木素DAB
儀器,、耗材 冰箱顯微鏡燒杯玻璃缸
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、烤片
68℃，20 min,。
二,、常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水
二甲苯I 20 min?二甲苯II 20 min?00%酒精10 min?100%酒精10 min?95%酒精5 min?80%酒精5 min?70%酒精5 min
三,、阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶
3%H2O2 37℃孵育10 min,，PBS沖洗3X5 min,。
四、抗原修復(fù)
置0.01 M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（95℃,，15-20 min），自然冷卻20 min以上,，再用冷水沖洗缸子,，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3X5 min,。
五,、正常羊血清工作液封閉，37℃10 min,，傾去勿洗,。
六、滴加一抗4℃冰箱孵育過夜,，PBS沖洗3X5 min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）,；滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min,，PBS沖洗3X5min,。
七、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液,，37℃孵育30 min,，PBS沖洗3X5 min。
八,、DAB/H2O2反應(yīng)染色,，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染,，常規(guī)脫水,，透明，干燥,，封片,。
卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法
實(shí)驗(yàn)材料 蠟塊切片
試劑、試劑盒 多聚甲醛蒸餾水蔗糖過氧化氫甲醇PBS酒精KPBS牛血清白蛋白疊氮納一抗二抗
儀器,、耗材 冰箱顯微鏡燒杯
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中過夜,。蠟塊制作,。切片，貼片,。0.01 M KPBS清洗5 min×3后,；
二,、加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80 ml+0.01 M KPBS 100 ml+30%過氧化氫）30 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響,，0.01M PBS清洗5 min×3,；
三、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100+0.01 M KPBS 100 ml）30 min,，以增加細(xì)胞的通透性,，0.01 M KPBS清洗5 min×3；
四,、加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00 g+0.01 M PBS 100 ml+疊氮納0.08 g）稀釋的一抗,，4℃存放24-48 h；吸去抗體,，0.01 M KPBS洗5 min×3,；
五、加入0.01 M KPBS稀釋的的二抗,，室溫孵育2 h,。0.01 M KPBS洗5 min×3；
六,、加入ABC復(fù)合物之類的抗體,，室溫孵育2 h，0.01 M KPBS洗5 min×3,；蒸餾水迅速?zèng)_三次,；
七、加入顯色液,，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色,，時(shí)間一般不超過30 min，可不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀察,，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液,，用蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入0.01 M KPBS終止反應(yīng)；
八,、梯度酒精脫水之后,，封片，拍照,。
鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物（SABC）法
實(shí)驗(yàn)方法原理
SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一種顯示組織和細(xì)胞中抗原分布的簡便而敏感的免疫組化染色方法,，是眾多免疫組織化學(xué)方法的一種。SABC法：一抗+ 生物素標(biāo)記二抗+ 滴加試劑SABC（鏈霉卵白素+ 辣根酶標(biāo)記生物素）+ 辣根酶底物顯色,。目前常用的親和素從鏈霉菌(streptomyces)培養(yǎng)物中提取,，因此稱為鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC法)。
生物素(biotin)為含硫的雜環(huán)單羧酸,，分子量小,，通過其羧基與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，從而可標(biāo)記抗體和酶,。親和素(avidin)又稱抗生物素蛋白,，是一種糖蛋白，在雞蛋白中被發(fā)現(xiàn),，分子量為68 000,。生物素與親和素有很高的親和力，1個(gè)親和素分子上有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn),。在ABC法中，不對(duì)特異性第一抗體進(jìn)行標(biāo)記,，而用生物素標(biāo)記第二抗體,，染色前按一定比例將親和素與生物素標(biāo)記的過氧化物酶混合，制成ABC合物,，并使親和素分子上至少空出1個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn),。染色時(shí)，標(biāo)本中的抗原先與第一抗體結(jié)合,，后者再與生物素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合,，然后加入ABC復(fù)合物，結(jié)合到第二抗體的生物素上,，最終形成的復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)了大量的酶分子,。因此，敏感性更高,。
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、洗載玻片
1. 將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中，目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,，同時(shí)使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,，便于組織吸附。
2. 置于清水中清洗,，除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4（大約沖一個(gè)小時(shí)左右）,。
3. 將載玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上,，置于37℃溫箱中,，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電,，而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷,，從而產(chǎn)生吸附作用。
二,、包埋組織
1. 在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟,，先稍微冷卻,，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊,。
2. 將塑料模具盒蓋上,，最后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍,，使石蠟變成固態(tài),。
三、切片
1. 將包埋好的組織從模具上取下來,，并置于石蠟切片機(jī)上,，切片機(jī)通過調(diào)節(jié)上下左右來來使組織和切割方向一致。
2. 調(diào)節(jié)切片的厚度,，一般為5 um,，如果比較難切，則可以適當(dāng)調(diào)整厚度,，用毛筆將切割的載玻片向外拉,，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40 ℃溫水中。
四,、撈組織
當(dāng)組織載玻片置于40 ℃溫水中之前,，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上,，組織受熱展開,，最好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時(shí),，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張,，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織,，做對(duì)照使用,，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時(shí)候最好方向一致,，以便觀察,，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37 ℃溫箱中烘干,。
五,、脫蠟
依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,，依據(jù)的是相似相溶的原理,。一般在每個(gè)試劑中放10 min，天氣熱可以少放幾分鐘，相反,，天氣較冷的話就要適當(dāng)延長脫蠟時(shí)間,，一般為12-15 min。
六,、抗原修復(fù)
脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間,，加入3%H2O2浸泡10 min，從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶,，然后倒掉H2O2,，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液,，放入微波爐中蒸煮3 min（中火）,，一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫,，然后再蒸煮一次,，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來,。
七、血清封閉
冷卻至室溫后,，將檸檬酸緩沖液倒掉,，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5 min,，洗2次,，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清,，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來,，然后放入37 ℃溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍（900 ul PBS：100 ul血清封閉液）,。
八,、加一抗
將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,，加一抗,，如果做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加PBS,。加完一抗后于4℃冰箱中保存過夜,。
九、加二抗
將載玻片從冰箱中取出,，放入PBS中洗3次,，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37℃溫箱中半小時(shí),。
十,、加SABC
將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min,，擦干組織周圍的PBS后加上SABC,， 然后置于37℃溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990ul PBS：10ul SABC）,。
十一,、加顯色劑
將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min,，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑,。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻,，然后加1滴顯色劑B,，搖勻，再加1滴顯色劑C,，搖勻） A：DAB B：H2O2 C：磷酸緩沖液
十二,、復(fù)染
將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色,，一般動(dòng)物組織為半分鐘,，植物組織3-5min。
十三,、脫水
將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后,，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min,，最后浸泡在二甲苯中,，搬到通風(fēng)柜中。
十四,、封片
用中性樹膠滴在組織旁邊,，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè),，然后輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干,。
